富血小板血浆(PRP)常温保存前后PDGF―AB、TGF―β1含量变化研究

【摘 要】目的：测定富血小板血浆(PRP)常温保存前后PDGF-AB、TGF-β1含量变化，评价其促进组织修复能力。方法：白膜回浆法制备PRP，双抗体夹心ABC-ELISA法检测静脉血、PRP保存前后(激活状态下)PDGF-AB和TGF-β1含量，数据结果应用SPSS　12.5软件处理分析。　结果：静脉血、PRP保存前后PDGF-AB浓度(pg/ml)分别为：1.69±0.36、56.12±11.72、58.17±12.1。TGF-β1　浓度(pg/ml)分别为：56.19±14.55、331.12±64.94、365.55±73.13。静脉血制备PRP后，PDGF-AB、TGF-β1含量明显升高。SPRP组与FPRP组比较，PDGF-AB浓度无显著性差异(P>0.05)、TGF-β1浓度有显著性差异(P<0.05)。结论：20～24℃连续温和振荡保存三天，PRP中可释放于局部的生长因子PDGF-AB无明显变化、TGF-β1含量明显升高。

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【关键词】富血小板血浆;保存;血小板源性生长因子-AB;转化生长因子-β1

【中图分类号】　R78 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2013)01-0034-02

在骨的自然修复过程中，有多种生长因子参与，其中以血小板源性生长因子-AB(Platelet-derived　growth　factors　AB PDGF)和转化生长因子-β1　(Transforming　growth　factors　beta　1 TGF-β1)最为重要[1]。本实验从口腔临床医学角度，研究20～24℃连续温和振荡保存后PRP中PDGF-AB、TGF-β1的含量变化，探讨其是否还具有高度的促进组织修复再生能力。为口腔临床高效制备、保存、合理利用、提高临床治疗效果及扩展PRP技术在口腔科的临床应用领域提供实验依据。

1　材料和方法

1.1　实验标本、仪器及试剂

1.1.1　实验标本 ACD-A抗凝静脉血，采用白膜回浆法制备PRP，共36例。(实验对象符合中华人民共和国献血体检标准，男27例，女9例，年龄28～43岁)

1.1.2　实验仪器及试剂 ACD-A抗凝液采血三联袋;血小板保存袋(CB-SD206C);Beckman-Conlter全自动五类血球分析仪;TGL　16G台式高速离心机;SHHW21.Cr　600三用电热恒温箱;TECAN全自动酶标扫描仪;XHZ-IIB血小板恒温振荡保存箱;牛凝血酶Sigma　T-4648;PDGF-AB、TGF-β1试剂盒(ELISA)。

1.2　实验方法

1.2.1　静脉血的采集 献血前抽取2ml置于未加抗凝剂的试管中(测静脉血PDGF-AB、TGF-β1含量)。献血约200ml，每袋取ACD-A抗凝血2ml(测静脉血血小板计数)，余静脉血制备PRP。

1.2.2　PRP的制备及保存 ACD-A抗凝三联袋采集约200ml静脉血，置低温离心机，于2h内离心沉淀(22℃　3600rpm/min，10min)，将上层血浆挤入1号浆袋，留白膜层以上约20ml血浆连同白膜层及部分红细胞约30ml　挤入2号浆袋，静置30～40min后，再离心沉淀(22℃　1300rpm/min，6min)，分出白膜层以上的混浊血浆约30ml，每份标本平均分为两袋，各约15ml，分别于当天和20～24℃连续温和振荡(频率60次/min)保存三天后检测PDGF-AB、TGF-β1含量。

1.2.3　血小板的激活及血清的制备

(1)静脉血血小板的激活及血清的制备　取18例非抗凝静脉血4℃保存，充分凝集后3000转/min离心20min，取上层血清转移到EP管中，用于检测静脉血PDGF-AB、TGF-β1含量。

(2)　PRP中血小板的激活及血清的制备　参照临床激活的方法[2]，取30例PRP标本各0.5ml，分别加入50μl凝血酶激活剂(500U牛凝血酶加入500μl　10%CaCl2溶液)，数分钟后凝聚成冻胶状，常温静置60min，3000r/min离心20min，吸取上层血清转移到EP管中，得到富生长因子血清(serum　rich　growth　factors　SRGF)。

1.2.4　检测指标及方法

(1)静脉血及保存前、后PRP的PLT浓度按仪器操作说明书上机全自动操作。

(2)静脉血及保存前、后PRP中PDGF-AB、TGF-β1含量采用双抗体夹心ABC-ELISA法进行检测。

(3)分别测量两袋PRP体积。

1.3　统计学方法

计量资料结果以均值±标准差(　±s)表示，FPRP、SPRP中的PLT、PDGF-AB、TGF-β1含量采用配对t检验，行差异显著性分析。分析软件为SPSS　12.5，显著性水准为α=0.05。

2　实验结果

2.1　静脉血、FPRP、SPRP三组中PLT的检测结果

如表1所示，静脉血制备PRP后，PLT明显升高。SPRP组与FPRP组比较，PLT计数无显著性差异(P>0.05)。

2.2　静脉血血清、FPRP血清、SPRP血清PDGF-AB、TGF-β1含量检测结果

如表2所示，静脉血制备PRP后，PDGF-AB、TGF-β1含量明显升高。SPRP组与FPRP组比较，PDGF-AB浓度无显著性差异(P>0.05)、TGF-β1浓度有显著性差异(P<0.05)。